Μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET)
Η μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET) είναι μια διαδικασία μεταφοράς ενέργειας χωρίς ακτινοβολία κατά την οποία η ενέργεια διεγερμένης κατάστασης του δότη μεταφέρεται στη διεγερμένη κατάσταση του δέκτη μέσω της αλληλεπίδρασης διαμοριακών ηλεκτρικών ζευγαριών.Αυτή η διαδικασία δεν περιλαμβάνει φωτόνια και επομένως είναι μη ακτινοβολούμενη.Αυτή η ανάλυση έχει τα πλεονεκτήματα ότι είναι γρήγορη, ευαίσθητη και απλή.
Η βαφή που χρησιμοποιείται στον προσδιορισμό FRET μπορεί να είναι πανομοιότυπη.Αλλά στις περισσότερες εφαρμογές, χρησιμοποιούνται στην πραγματικότητα διαφορετικές βαφές.Εν συντομία, η μεταφορά φωτεινής ενέργειας συντονισμού είναι η μεταφορά ενός ζεύγους διπόλων από τον δότη (χρωστική 1) στον δέκτη (χρωστική 2) όταν η ομάδα δότη είναι διεγερμένη.Γενικά, το φάσμα εκπομπής της ομάδας φθοροφόρου Δότη επικαλύπτεται με το φάσμα απορρόφησης της ομάδας Δέκτη.«Όταν η απόσταση μεταξύ των δύο φθοροφόρων είναι κατάλληλη (10-100 Α), μπορεί να παρατηρηθεί η μεταφορά της ενέργειας φθοροφόρου από τον δότη στον δέκτη».Η μέθοδος μεταφοράς ενέργειας εξαρτάται από τη χημική δομή του υποδοχέα:
1. Μετατρέπεται σε μοριακή δόνηση, δηλαδή εξαφανίζεται το φωτεινό φως της μεταφοράς ενέργειας.(Ο υποδοχέας είναι σβήσιμο φωτός)
2. Η εκπομπή είναι πιο έντονη από τον ίδιο τον υποδοχέα, με αποτέλεσμα μια μετατόπιση προς το κόκκινο στο δευτερεύον φάσμα φθορισμού».(Οι υποδοχείς είναι φωτεινοί εκπομποί).
Η ομάδα δότη (EDANS) και το γονίδιο δέκτη (DABCYL) συνδέονται ομοιόμορφα με το φυσικό υπόστρωμα της πρωτεάσης HIV και όταν το υπόστρωμα δεν αποσυνδεθεί, το DABCYL μπορεί να σβήσει το EDANS και στη συνέχεια να γίνει μη ανιχνεύσιμο στο φθόριο.Μετά την αποσύνδεση της πρωτεάσης HIV-1, το EDANS δεν σβήνει πλέον από το DABCYL και οι λουσιφεράσες EDANS μπορούν στη συνέχεια να ανιχνευθούν.Η διαθεσιμότητα των αναστολέων πρωτεάσης μπορεί να παρακολουθηθεί με αλλαγές στην ένταση φθορισμού του EDANS.
Τα πεπτίδια FRET είναι βολικά εργαλεία για τη μελέτη της μη εξειδίκευσης της πεπτιδάσης.Δεδομένου ότι η διαδικασία αντίδρασής του μπορεί να παρακολουθείται συνεχώς, παρέχει μια βολική μέθοδο για την ανίχνευση της ενζυμικής δραστηριότητας.Η γυαλάδα που παράγεται μετά την υδρόλυση των πεπτιδικών δεσμών από τον δότη/δέκτη παρέχει ένα μέτρο της ενζυμικής δραστηριότητας σε νανομοριακές συγκεντρώσεις.Όταν το πεπτίδιο FRET είναι άθικτο, δείχνει μια ξαφνική εξαφάνιση της εσωτερικής λάμψης, αλλά όταν σπάσει οποιοσδήποτε πεπτιδικός δεσμός απέναντι από τον δότη/δέκτη, απελευθερώνει ένα φλας, το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί συνεχώς και η δραστηριότητα του ενζύμου μπορεί στη συνέχεια να ποσοτικοποιηθεί.
Ώρα δημοσίευσης: Αυγ-14-2023