Τεχνολογία πεπτιδίου FRET

Μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET)

Η μεταφορά ενέργειας συντονισμού φθορισμού (FRET) είναι μια διαδικασία μεταφοράς ενέργειας μη ακτινοβολίας στην οποία μεταφέρεται η ενεργειακή ενέργεια που διεγείρει ο δωρητής στην κατάσταση που διεγείρει τον δέκτη μέσω της αλληλεπίδρασης των διαμοριακών ηλεκτρικών ζευγαριών. Αυτή η διαδικασία δεν περιλαμβάνει φωτόνια και επομένως δεν είναι μη ακτινοβολία. Αυτή η δοκιμασία έχει τα πλεονεκτήματα της γρήγορης, ευαίσθητης και απλής.

Η βαφή που χρησιμοποιείται στη δοκιμασία FRET μπορεί να είναι πανομοιότυπη. Αλλά στις περισσότερες εφαρμογές, χρησιμοποιούνται πραγματικά διαφορετικές βαφές. Εν συντομία, η μεταφορά της ενέργειας φωτεινού συντονισμού είναι η μεταφορά ενός ζεύγους διπόλων από τον δότη (βαφή 1) στον δέκτη (βαφή 2) όταν η ομάδα δότη είναι ενθουσιασμένη. Γενικά, το φάσμα εκπομπών της ομάδας φθοροφόρου δότη επικαλύπτεται με το φάσμα απορρόφησης της ομάδας αποδέκτη. "Όταν η απόσταση μεταξύ των δύο φθοροφόρων είναι κατάλληλη (10 - 100 α), μπορεί να παρατηρηθεί η μεταφορά της ενέργειας φθοροφόρου από τον δότη στον δέκτη." Η μέθοδος μεταφοράς ενέργειας εξαρτάται από τη χημική δομή του υποδοχέα:

1. Μετατρέπεται σε μοριακές κραδασμούς, δηλαδή το φωτεινό φως της μεταφοράς ενέργειας εξαφανίζεται. (Ο υποδοχέας είναι ένας ελαφρύς σβήστος)

2. Η εκπομπή είναι πιο έντονη από τον ίδιο τον υποδοχέα, με αποτέλεσμα μια ερυθρή μετατόπιση στο δευτερεύον φάσμα φθορισμού. " (Οι υποδοχείς είναι φωτεινές εκπομπές).

Η ομάδα δότη (EDANS) και το γονίδιο αποδέκτη (DABCYL) συνδέονται ομοιόμορφα με το φυσικό υπόστρωμα της πρωτεάσης HIV και όταν το υπόστρωμα δεν αποσυνδεθεί, το dabcyl μπορεί να Quenle edans και στη συνέχεια να γίνει μη ανιχνεύσιμο σε φθορίνη. Μετά την αποσύνδεση της πρωτεάσης HIV-1, ο Edans δεν σβήνεται πλέον από το DABCYL και οι Edans λουσιφερώσεις μπορούν στη συνέχεια να ανιχνευθούν. Η διαθεσιμότητα αναστολέων πρωτεάσης μπορεί να παρακολουθείται με μεταβολές στην ένταση φθορισμού των edans.

Τα πεπτίδια FRET είναι βολικά εργαλεία για τη μελέτη της μη ειδικότητας πεπτιδάσης. Δεδομένου ότι η διαδικασία αντίδρασης μπορεί να παρακολουθείται συνεχώς, παρέχει μια βολική μέθοδο για την ανίχνευση της δραστικότητας του ενζύμου. Η λάμψη που παράγεται μετά την υδρόλυση των πεπτιδίων δεσμών από τον δότη/δέκτη παρέχει ένα μέτρο ενζυμικής δραστικότητας σε νανομοριακές συγκεντρώσεις. Όταν το πεπτίδιο FRET είναι άθικτο, δείχνει μια ξαφνική εξαφάνιση του εσωτερικού φλας, αλλά όταν οποιοσδήποτε πεπτιδικός δεσμός απέναντι από τα σπάσιμο του δότη/δέκτη, απελευθερώνει ένα φλας, το οποίο μπορεί να ανιχνευθεί συνεχώς και η ενζυμική δραστηριότητα μπορεί στη συνέχεια να ποσοτικοποιηθεί.