Η αρχή λειτουργίας και η προετοιμασία του αντιδραστηρίου Limulus τριπεπτίδιο/υπόστρωμα ενδοτοξίνης

Το τριπεπτίδιο αντιδραστηρίου Limulus είναι μια τριπεπτιδική ουσία με συγκεκριμένη αλληλουχία που εκχυλίζεται από κυτταρόλυμα αιμοσφαιρίου πεταλούχου καβουριού ή συντίθεται τεχνητά. Το τριπεπτίδιο αντιδραστηρίου Limulus είναι ένα χρωμογόνο υπόστρωμα που χρησιμοποιείται για ποσοτική ανάλυση (όπως το τεστ βακτηριακής ενδοτοξίνης) για την ανίχνευση και τη μέτρηση των συστατικών των αρνητικών κατά Gram βακτηρίων—ενδοτοξίνες. Όταν επενεργείται από ένζυμα που ενεργοποιούνται από τις ενδοτοξίνες, απελευθερώνεται μια έγχρωμη ένωση (όπως π-νιτροανιλίνη), επιτρέποντας τη μέτρηση της έντασης του χρώματος και τον συσχετισμό με την περιεκτικότητα σε ενδοτοξίνες.

Αρχή Εργασίας

Ενεργοποίηση ενδοτοξίνης: Παρουσία ενδοτοξινών, τα αμεβοκύτταρα στο αίμα του πεταλοειδούς καβουριού απελευθερώνουν ένζυμα, πυροδοτώντας έτσι τον καταρράκτη της πήξης.

Ενζυμική δράση: Το ενεργοποιημένο ένζυμο (συνήθως το ένζυμο πήξης) δρα στη συνέχεια σε ένα χρωμογόνο υπόστρωμα.

Χρωμογονική Αντίδραση: Το ένζυμο διασπά το υπόστρωμα, απελευθερώνοντας μια κίτρινη ένωση που ονομάζεται π-νιτροανιλίνη (pNA).

Ποσοτική ανάλυση: Η ένταση του κίτρινου χρώματος είναι ανάλογη με την περιεκτικότητα σε ενδοτοξίνη στο δείγμα και συνήθως μετριέται με χρήση φασματοφωτόμετρου σε απορρόφηση 405 nm.

Μέθοδοι Παρασκευής

Το τριπεπτίδιο αντιδραστηρίου Limulus μπορεί να ληφθεί με δύο προσεγγίσεις όσον αφορά την παρασκευή.

1. Εξαγωγή φυσικών συστατικών από τα αιμοσφαίρια Limulus και λήψη του ενεργού τριπεπτιδίου μέσω διαχωρισμού και καθαρισμού.

2. Χρήση τεχνολογίας σύνθεσης στερεάς φάσης για τη διαδοχική σύνδεση συγκεκριμένων αλληλουχιών αμινοξέων, ελέγχοντας με ακρίβεια τη δομή του τριπεπτιδίου.

Λόγω των πολιτικών διατήρησης για το Limulus (με επαρχίες όπως το Zhejiang, το Fujian, το Guangdong και το Guangxi να το αναφέρουν ως "επαρχιακό κλειδί προστατευμένη υδρόβια άγρια ​​ζωή" / το Χονγκ Κονγκ εξέδωσε κανονισμούς στα τέλη του 2012 που απαγορεύουν την τράτα βυθού) και επειδή η διαδικασία εξόρυξης είναι πολύπλοκη και η πρώτη μέθοδος είναι σχετικά υψηλή. Επομένως, η σύνθεση στερεάς φάσης χρησιμοποιείται πλέον ευρέως. Με τη διαδοχική σύνδεση συγκεκριμένων αλληλουχιών αμινοξέων, η δομή του τριπεπτιδίου μπορεί να ελεγχθεί με ακρίβεια. Αυτή η μέθοδος όχι μόνο διασφαλίζει τη σταθερότητα και τη συνοχή του προϊόντος αλλά επιτρέπει επίσης την παραγωγή μεγάλης κλίμακας, καλύπτοντας τις ανάγκες της φαρμακευτικής βιομηχανίας για δοκιμή αντιδραστηρίων.